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蛋白質凝膠污漬 - 許多選擇,許多解決方案

如果有一件事伱可以指望在今天的分子生物學實驗室找到它,它是一個蛋白質凝膠電泳設備。研究人員使用蛋白質凝膠按尺寸和/或在2D凝膠電荷的情況下解析蛋白質,無論是準備進行蛋白質印迹  還是質譜,或僅僅通過眼睛篩選蛋白質表達。

但與DNA凝膠一樣,僅僅分離凝膠中的蛋白質是不夠的; 他們也必須染色。事實證明,有幾種方法可以使蛋白質可見。使用哪種方法是靈敏度要求,可用硬件和下遊應用的函數。

基本染色方法

研究人員可以使用三種主要類别的染色劑來治療他們的日常蛋白質凝膠:考馬斯,銀和熒光。根據Sigma-Aldrich蛋白質技術和分析的**研發經理Jeffrey Turner的說法,在這些選項之間進行選擇主要歸結為“靈敏度與速度”。

特納西說,考馬斯可能是**常用的染色劑,作為一種視覺,比色(亮藍)染料,它不需要特殊設備。Bio-Rad Laboratories的業務發展經理Ning Liu表示,它的靈敏度**低,檢出限約為10-100 ng蛋白質。

公司通常提供多種染料配方,其易用性,總染色時間和緩沖劑和脫色要求各不相同。例如,一些需要固定在酒精/酸洗液中,而另一些則需要使用純淨水。将Expedeon的InstantBlue TM  試劑(也可從Sigma-Aldrich獲得)在電泳後直接添加到凝膠中,不需要固定或脫色,并且在約15分鐘内完成染色。另一方面,Bio-Rad Laboratories的QC Colloidal Coomassie Stain方案建議采用更長的程序來滿足工業質量控制标準,包括在染色之前在40%乙醇/ 10%乙酸中進行15分鐘的凝膠固定步驟。一小時20小時,然後在水中脫水一**三小時。

研究人員可以使用賽默飛世爾科技公司  **新發布的Pierce™Power Stainer 自動進行考馬斯染色。根據全球産品經理Emily Goplen的說法,該設備可以一步染色并脫色兩種凝膠。“雖然傳統染色需要花費數小時才能過夜,但Power Stainer可在約10分鐘内完成染色和脫色過程,并可與預制[或]自制SDS-PAGE凝膠配合使用,”她說。

另一個極端是銀染,一種視覺方法,靈敏度為每條帶約100 pg**250 pg(0.1 ng**0.25 ng)。劉說,該協議沒有脫色步驟,但是“它是一個漫長的過程” - 兩個小時左右 - 并且相當挑剔。“此外,特納補充說,該協議涉及幾種有毒化學品,如甲醛和銀,通常在通風櫥中進行。因此,劉說,“除非敏感性**關重要,否則人們通常會遠離這一程序”。

在中間,靈敏度方面,熒光染料,可以檢測單位數納克範圍内的蛋白質,隻要您可以訪問兼容的凝膠文件  系統或透射儀。

與考馬斯和銀染一樣,熒光染色在電泳後使用,并且通常需要固定和脫色。但情況并非總是如此。例如,劉說,盡管SYPRO Ruby需要脫色步驟,但Oriole和Flamingo凝膠染色劑不會,因為遊離染料不會發熒光。“[染料]本身不能被激光激發,”他解釋說,“隻有當它被蛋白質結合時。這就是伱不需要洗掉它的原因。“

補充這些選項,也存在特殊試劑。例如,Thermo Fisher Scientific  專門針對糖基化和磷酸化蛋白提供Pro-Q®熒光染色,以及用于标記融合蛋白的納克級可視化的InVision™ His标簽凝膠染色和Lumio™綠色檢測試劑盒。

預電泳染色

一些公司提供染色解決方案,消除電泳後的洗滌和染色。例如,Bio-Rad的Stain-Free™預制凝膠預先加載了色氨酸結合的“三鹵”熒光染料。電泳後,将凝膠暴露于紫外光下會激活染料,使其與蛋白質共價結合。據劉說,靈敏度“與考馬斯相當”。

另一種選擇是 GE Healthcare Life Sciences業務的Amersham™WB系統。使用該系統,樣品在電泳之前以10或30分鐘的反應共價偶聯**Cy TM 5熒光團。去污劑不是必需的 - 染料從染料前端流出凝膠 - 靈敏度在50到100-pg範圍内,**小動态範圍為三個數量級,GE的**科學家ÅsaHagnerMcWhirter說道醫療生命科學。McWhirter說:“伱甚**不需要拆開凝膠盒”來看凝膠圖案。系統在電泳結束時直接自動對凝膠成像并分析結果。

Liu和McWhirter都指出,電泳前染色方法的一個顯着優點是染料與分離的蛋白質共價連接。因此,可以在随後的步驟中使它們可視化,特别是在蛋白質印迹中,并且使用總蛋白質信号而不是選擇的“管家” - 蛋白質水平來标準化西方靶标信号。(通過使用諸如考馬斯藍,Ponceau S和Thermo Fisher Scientific的Pierce™可逆蛋白質染料等試劑,也可以對西方膜進行染色以獲得總蛋白信号。)

“這種方法顯然消除了人們對家政 - 蛋白質負荷控制的兩大擔憂,”劉說。首先,管家蛋白質水平有時會在實驗條件下發生變化。它們也可能存在于印迹線性動态範圍之外的水平,使量化變得複雜。實際上,他指出,生物化學雜志**近更新了其作者指南,以反映這一事實。“将信号強度标準化為總蛋白質負荷(通過使用考馬斯藍,麗春紅S或其他蛋白質染色劑染色膜評估)是優選的,”指南現在說明。“沒有證據證明實驗操作不影響其表達,'不應該使用'保持'的蛋白質進行标準化。”

McWhirter表示,預标記還可顯着提高凝膠與凝膠的重現性,因為洗滌和染色步驟難以精确控制。“伱在管中進行的反應之間的CV [方差系數]遠低于使用托盤​​在不同溶液中孵育凝膠,”她指出。實際上,她聲稱在對14個相同樣本的一次内部分析中,蛋白質Cy5信号的CV平均約為5%。“這基本上和移液錯誤一樣好。”

**後的考慮

無論您選擇哪種污漬,除敏感度,速度和硬件要求外,還有一個關鍵考慮因素是您打算使用凝膠下遊。例如,研究人員通常不會在印迹之前用考馬斯藍染色凝膠,因為該染料通常需要固定步驟,可以将蛋白質捕獲在凝膠中; 相反,它們要麼平行運行第二個相同的凝膠并染色,要麼在轉移後染色印迹。類似地,共價附着于蛋白質的染料可能潛在地幹擾抗體結合或質譜分析。

Goplen說,**終,沒有一個通用的解決方案。所有人都同意,考馬斯是大多數研究人員的**染色劑。但是當出現特殊情況時,知道還有很多其他選擇可能不是很好嗎?

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