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改善蛋白質印迹重複性

重複性對于科學過程**關重要,使其他實驗室能夠驗證并在已發布的結果基礎上進行構建。但越來越明顯的是,科學文獻并不總能滿足這些期望。這種不确定性大部分源于方法細節的報告不一緻,導緻對結果的錯誤解釋。這些方法本身也可能導緻不可再現性。

2013年,Nature推出了  新的編輯标準,以提高生命科學文獻報道的一緻性和質量。這些标準要求作者“描述可能引入偏倚或影響穩健性的方法學參數[1],”包括“反映測定和/或樣品制備[2]變異的技術重複”。

蛋白質印迹是一種具有固有變異性的方法。不同的抗體批次和克隆可能表現不同,因此很難比較實驗室之間甚**同一實驗室内的結果。凝膠加載,轉移效率和其他因素是額外的,公認的可變性來源。

Western blotting的另一個關鍵方面受到較少關注:檢測和成像。這一方面對于定量比較**關重要,蛋白質水平的相對分析越來越常見。使用比色,化學發光或熒光方法用标記的抗體檢測蛋白質印迹。化學發光檢測是**常用的方法,也是**難以準确量化的方法。

LI-COR Biosciences的科學家**近研究了化學發光蛋白質印迹成像中的變異性和誤差來源。在這裡,我們回顧他們的發現。

化學發光的局限性

化學發光蛋白質印迹使用酶綴合的抗體來催化反應。底物分子的氧化産生瞬态光信号。當反應發生時,發射的光用X射線膠片或數字成像器成像。

化學發光蛋白質印迹成像的可變性和誤差來自兩個關鍵來源:酶化學發光反應的動力學,以及發現捕獲微弱和強信号的“**佳”暴露的挑戰。

化學發光檢測的酶促性質使得靈敏度高但依賴于底物濃度。這是一個問題,因為底物濃度随着反應的繼續而變化 - 并且在印迹的不同區域以不同的速率變化。在具有高抗體濃度(強條帶)的區域比低濃度(較暗條帶)更快地消耗底物。

随着反應的進行,基闆可用性的變化會影響強和微弱帶的相對信号強度。如果較少的基闆可用于氧化,則較強的信号變得不足。這種不可預測的,無聲的可變性來源取決于圖像捕獲的時間和印迹上的試劑分布。由此産生的可變性可能限制從一個實驗到下一個實驗的再現性。

此外,大多數印迹成像方法需要多次曝光以記錄該方法的線性範圍内的微弱和強帶。但是,在甚**檢測到較弱的信号之前,強烈的信号可能會使許多檢測方法的容量飽和或“爆炸”。短時間曝光通常用于捕獲線性範圍内的強條帶,然後進行更長時間的曝光以檢測較暗的條帶。在單次曝光中準确捕獲所有信号強度幾乎是不可能的,并且反應的動态性質使得識别“**佳”曝光時間變得更加困難。

在線性範圍内成像

檢測方法的線性範圍決定了多次暴露的必要性,以及酶/底物動力學對結果的潛在影響。理想的成像方法可以捕獲單次曝光中的所有數據,在線性檢測範圍内捕獲微弱和強烈的條帶。

我們比較了X射線膠片,商用CCD成像系統(“Imager B”)和LI-COROdyssey®FcImager的線性檢測範圍。一個Harta發光計參考闆,有七個LED,産生超過七個數量級的一緻光,用作光源。(見圖1)

圖1. 各種方法的線性檢測範圍

薄膜呈現出非常窄的線性範圍,不适合廣泛的信号強度。成像器B顯示出改進的線性範圍,盡管在較長曝光期間強信号仍然飽和。LI-COR Odyssey Fc成像儀是三者中**好的,具有非常寬的線性範圍并且沒有觀察到信号飽和。該系統在所有曝光時間内捕獲單個圖像中的微弱和強信号。

與其他基于CCD的成像器不同,Odyssey Fc系統獨特的光學技術可以帶來微弱的條帶,而不會使較強的條帶飽和,并且可以在非常寬的動态範圍内(**多6個日志)進行飽和。無需優化圖像捕獲設置,單個數字圖像可替換多個曝光的疊加。

在一次曝光中捕獲所有信号減少了化學發光檢測動力學引入的可變性。在酶促反應的同一階段收集微弱和強烈的條帶,以獲得更一緻的底物可用性和更可靠的定量分析-特别是當條帶強度變化時。該系統還檢測兩個波長的近紅外熒光信号并對DNA凝膠成像。

提高蛋白質印迹的重現性

當然,可以從膠片或标準數字成像器獲得可靠的結果。您需要仔細校準每個實驗的線性範圍。使用内部對照進行标準化可以提高精确度,但要确保在系統的線性範圍内檢測到對照和目标蛋白質。提高精度可能需要稀釋系列,額外的控制和大量的技術重複。

新的自然報告要求強調了在線性範圍内檢測的重要性,并且不鼓勵使用僅顯示強烈波段的短曝光。對于電泳和凝膠數據,指南指出,“必須使用具有線性信号範圍的适當試劑,對照和成像方法。曝光通常應該是産生灰色背景。不鼓勵使用高對比度的凝膠和印迹,因為過度曝光可能掩蓋其他條帶。如果高對比度是不可避免的,應在補充信息中提供多次曝光[2]。

該研究表明,LI-COR Odyssey Fc成像儀可以為化學發光蛋白質印迹提供更準确,定量的解決方案。消除多次曝光的需要簡化了數據分析,并**大限度地減少了化學發光檢測過程中酶/底物動力學引入的變異性。在單個圖像中捕獲全部數據有助于您獲得始終如一的可靠結果-并且更容易滿足發布Western印迹數據的新的,越來越嚴格的要求。

完整的研究“Western Blots的膠片和CCD成像:曝光時間,信号飽和度和線性動态範圍”(LI-COR Biosciences,2014)可在此處獲得。

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