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提交凝膠切片進行蛋白質測定時,請注意角蛋白和其他雜質

質譜(MS)是一種基于質量差異表征和定量蛋白質的方法。當蛋白質在實驗室中無法解決時,研究人員通常會将從凝膠中切下的條帶提交給專門的MS設施進行蛋白質測定。然而,這項服務的價格為每5毫米凝膠切片180美元。重要的是要注意設施可能提交的任何指導方針或限制。為了獲得**大收益,我們收集了以下建議。 

避免角蛋白污染

當使用1D或2D凝膠/ MS和液相色譜(LC)/ MS平台時,角蛋白污染是常見問題。角蛋白是一種天然存在的蛋白質,常見于指紋,頭發,死皮,羊毛衣物,DTT,β-巯基乙醇,緩沖劑和乳膠手套。在低濃度下,角蛋白不是問題。但是當角蛋白的濃度大于目标蛋白質時,角蛋白會壓倒MS系統。為盡量減少污染,請始終穿上實驗室外套并使用非乳膠手套。任何接觸凝膠或樣品的物質都可能是污染源。在澆鑄之前用70%乙醇徹底清洗所有闆。避免将凝膠存放在保鮮膜中,并使用新的,幹淨的塑料或玻璃凝膠托盤。将凝膠置于幹淨的容器中,用70%乙醇或甲醇/乙腈徹底沖洗。在層流罩或其他清潔工作區域内進行整個凝膠内消化。沒有什麼比提交樣本隻是為了獲得無價值的數據 - 或者沒有數據 - 的回報更糟糕的了。

尋找胰蛋白酶

盡管每種樣品在各種MS平台的制備,電離和檢測方面都有獨特的要求,但是存在一些适用于試劑的一般限制。胰蛋白酶消化産生不同分子量的肽用于MS分析,但胰蛋白酶的特異性值得注意。天然胰蛋白酶經曆自溶,産生假胰蛋白酶,其表現出更寬的特異性。在胰蛋白酶制劑中存在的自溶産物導緻額外的肽片段,其可能阻礙正确的蛋白質鑒定。

注意染色限制

染色要求非常具體。确保蛋白質在染色過程中不會共價修飾或不可逆地固定在凝膠中。當通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質複合物的各個組分并通過銀(或考馬斯)染色顯現時,重要的是使用不含戊二醛的銀染方案。戊二醛化學修飾蛋白質并抑制後續步驟。對于低豐度蛋白質(通常需要通過銀染可見的那些),為了确保您的蛋白質存在于适當的檢測限度,通過在多個泳道(10μl**10μl)中運行樣品,将多個凝膠條帶組合起來是值得的。總共30μl)。對于SDS-凝膠樣品,如果可見帶有考馬斯藍染色的條帶(檢測限,100 ng),則可能存在足夠的材料用于蛋白質鑒定。污漬的檢測限也取決于諸如凝膠厚度和泳道寬度的變量。

仔細切除凝膠帶

在剪切任何樂隊之前拍攝圖像是個好主意。提交一份帶有樣本的副本,并指出切割帶的位置。切割感興趣的條帶時,每個樣品都應使用無菌剃刀刀片或手術刀。丙烯酰胺在MS分析中含有許多幹擾劑,因此使其存在**小化。省略漫射染色邊緣并僅切除明顯染色的條帶。捕獲太少的凝膠意味着樣品的損失和太多的凝膠可能降低肽的産率。發現有一個很好的平衡!(MS設施總是試圖引入産生有用光譜所需的**少量的材料。太多的樣品意味着更高的背景信号,需要停機時間進行清潔。)另外,不要将凝膠切碎,因為小塊很容易丢失。僅提交完整的樂隊。将每個凝膠帶放入單獨的幹淨微量離心管中。不要使用任何帶O形圈或墊圈的管子。不要用封口膜或膠帶密封,因為它們也是角蛋白污染的常見來源。始終提交空白凝膠切片用作對照。将沒有任何液體的碎片存放在-20°C或-80°C的微量離心管中,直到您準備好提交您的皮帶。

提交凝膠切片後,MS設施提供的信息越多越好。請記住,純化的樣品總是**有可能進行陽性鑒定。分析純淨的低分子量有機化合物很容易; 混合物更難; 對高分子量化合物的複雜混合物進行綜合分析可能非常耗時。但如果您有截止日期,那麼大規模設施将與您合作。畢竟,伱是顧客!祝伱好運。

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