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液相色譜-高分辨飛行時間質譜法測定食品接觸紙包裝材料中的7種熒光增

1 引 言
 
熒光增白劑( Fluorescent whitening agents,FWA) 是一種熒光染料,常被用于紙、塑料等行業的生産中,以提高産品的白度和豔度。鑒于熒光增白劑可能通過食品包裝遷移到食品,被人體吸收後會對人體造成危害,各國對熒光增白劑進行了監管,制定了允許用于生産食品接觸材料的熒光增白劑清單,如歐盟 2002 /72 /EC1列出了 FWA 393,FWA 184,FWA 236 和 FWA 368 等塑料用熒光增白劑,并明确規定
[2];
食品包裝紙**終産品的熒光增白劑的限制為“檢測不到該物質遷移到食品中的量” 我國列出了
 
FWA 393,FWA 184 和 FWA 236 3 種塑料用熒光增白劑3,同時規定紙包裝産品“生産過程中不得使
[4]
用熒光增白劑” 。因此 建立食品接觸紙包裝材料中熒光增白劑的快速定性與定量檢測方法 有利于對可能存在的違禁添加熒光增白劑行為進行監管。
 
目前,常用的熒光增白劑的檢測方法有紫外燈照射觀測法( ULO) 5、薄層層析法( TLC) 6、液相色譜法( HPLC) 67和液相色譜串聯三重四級杆質譜法( LC-MS /MS) 78等。ULO、TLC 和 HPLC 的方法靈敏度和選擇性較差; LC-MS /MS 采用 MRM 模式檢測,靈敏度高,抗幹擾能力強,但仍受分辨率、掃描速率和模式的限制,不能滿足快速篩查的需求。高效液相色譜串聯高分辨飛行時間質譜( LC-TRIPLE-TOF)
[9 ~ 11],
不僅具備了高分辨飛行時間質譜能測得化合物及其碎片離子的分子式和精确分子量數據的特性
 
同時具備完全定性、同時定性定量、完全定量 3 種( Triple) 工作流程,在 LC-TRIPLE-TOF 的 TOF MS 觸
 
發 TOF MS /MS 的模式下檢測,可以根據保留時間、一級離子質量準确度、一級離子同位素分布、二級碎
 
片與譜庫匹配 4 [12] 。目前尚未見應
種手段準确定性,具有高分辨率、高靈敏度和高掃描速度等特點
用 LC-TRIPLE-TOF 分析熒光增白劑的報道。
 
本研究采用液相色譜串聯高分辨飛行時間質譜技術,以食品接觸紙包裝材料中 FWA368,FWA367,FWA185,FWA184,FWA52,FWA135 和 FWA393( 結構圖見表 1) 7 種熒光增白劑為研究對象,建立了 7 種熒光增白劑的 MS /MS 數據庫,并通過優化前處理方法和色譜質譜條件,建立了食品接觸紙質包裝材料中熒光增白劑的定性确證及定量檢測方法。
 
2 實驗部分
 
2. 1  儀器與試劑
 
TRIPLE TOF 4600 高分辨質譜儀( 美國 AB SCIEX 公司) ; SHIMADZU-30A 高效液相色譜儀系統,包括二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱 ( 日本 Shimadzu 公司) ; MS3 basic 漩渦混合器 ( 德國 IKA 公司) ;
 
KQ-250DV 型數控超聲波清洗儀( 昆山市超聲儀器有限公司 ) ; Milli-Q 去離子水發生器 ( 美國
 
Millipore 公司) 。
 
7 種熒光增白劑标準品: FWA 368,FWA 367,FWA 184,FWA 52 和 FWA 393( 梯希愛( 上海) 化成工業發展有限公司) ; FWA 185 和 FWA 135 ( Internatioanal laboratory U. S. A) 均購于安譜公司; 甲醇 ( HPLC 級,德國 Merck 公司) ; 甲酸( HPLC 級,德國 CNW 公司) ; 三氯甲烷( 分析純,廣州) ; 超純水 ( 18. 2 MΩ cm) 。
 
檢測樣品為各種紙質食品包裝材料,包括紙杯、紙巾、紙質蛋糕托、紙盒等共 13 個,購于廣州市場。
 
2. 2 标準溶液的配制
 
準确稱取各标準品,用三氯甲烷配成 100 mg /L 的單标标準貯備液,再用三氯甲烷-甲醇( 1∶ 9,V /V) 配成 7 種熒光增白劑的混合标準貯備液和所需濃度的标準工作液,!20 ℃ 保存。
2. 3 樣品的處理和加标樣品的處理
 
用适當的工具将樣品剪成約 5 mm ×5 mm 大小,混合均勻,制樣過程中注意防止污染。
 
樣品處理: 準确稱取 1. 0 g( 精确** 0. 001 g) 試樣于 25 mL 具塞比色管中,加入 20 mL 三氯甲烷,超聲提取 30 min,取出放**室溫後,定容。取 10 mL 提取液于 15 mL 氮吹管中,于 40 ℃ 水浴中氮吹濃縮**幹,用三氯甲烷-甲醇( 1∶ 9,V /V) 定容** 1. 0 mL,過 0. 22 μm 有機濾膜,待 LC-Triple TOF MS 測定。
 
加标樣品處理: 準确稱取 1. 0 g( 精确** 0. 001 g) 陰性試樣于 25 mL 具塞比色管中,加入合适濃度的混合标準溶液,讓樣品吸取标液并室溫放置**幹後按上述樣品處理。
2. 4 色譜和質譜條件
 
Phenomenex Kinetex C18 色譜柱( 100 mm×2. 1 mm i. d. ,2. 6 μm) ; 流動相: A 為甲醇,B 為 0. 1 甲酸,梯度洗脫: 0. 0 ~ 4. 0 min,60% ~ 100% A; 4. 0 ~ 10. 0 min,100% A; 10. 0 ~ 10. 1 min,100% ~ 60%
A; 10. 1 ~ 14. 0 min,60% A; 流速: 0. 4 mL /min; 柱溫: 40℃ ; 進樣量: 10 μL。
 
質譜條件: ESI 正模式,電離電壓( IS) 5500 V; 霧化氣( GAS1) 382 kPa; 輔助加熱氣( GAS2) 382 kPa; 輔助加熱氣溫度( TEM) 550 ℃ ; 檢測模式: 飛行時間全掃描質譜和二級質譜( TOF MS IDA MS-MS) 模式;
TOF-MS 掃描範圍為 m /z 100 ~ 1000,TOF-MS 觸發二級掃描範圍 m /z 100 ~ 1000; 去簇電壓 ( DP ) 80 V; MS-MS 碰撞能量( CE) 35 eV; 擴展碰撞能量( CES) 15 eV。
 
在上述條件下獲得的二級質譜譜圖,建立 7 種熒光增白劑的 MS /MS 數據庫,包括分子式、相對分子
 
質量、CAS 編号、化學名及結構圖等。
 
2. 5 定性篩查與定量檢測
 
應用軟件中的 XIC Manger 功能處理采集的數據,根據保留時間和質量準确度( 表 1) ,同位素分布,以及譜庫檢索進行定性分析; 以提取一級母離子的峰面積進行定量分析。
 
3 結果與讨論
 
3. 1  前處理條件的優化
 對比了甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃等有機溶劑,發現 FWA52 和 FWA184 在甲醇和乙醇中有較好的溶解度,而其餘 5 種在三氯甲烷中的溶解度**好。基于此 ,實驗考察了提取溶劑為氯仿,以及氯仿與甲醇混合溶液( 比例分别為1 ∶ 1 ,1 ∶ 2 ,1 ∶ 3 ,1 ∶ 4 和1 ∶ 5 ,
 


3. 2 色譜和質譜條件的選擇
 
7 種待研究 FWAs 在 ESI+ 模式下均得到[M +H]+ 的準分子離子峰,在流動相中加入甲酸能增加
 
FWAs 的離子化效率。考察了乙腈-0. 1% 甲酸和甲醇-0. 1% 甲酸流動相體系對 7 種待研究 FWAs 的色譜行為和離子化程度。結果表明,當流動相為甲醇-0. 1% 甲酸時,7 種待研究 FWAs 的儀器響應值均高于乙腈-0. 1% 甲酸為流動相時的響應值。故本實驗選擇甲醇-0. 1% 甲酸水作為流動相,并對梯度洗脫程序進行了優化,可以在 5. 5 min 内完成 7 種化合物的分析。
 
應用 TRIPLE-TOF IDA MS-MS 檢測,可以采用庫檢索或手工譜圖解析的方法處理數據。為了實現對未知物的譜庫篩查或推測結構,以及實現對已知目标物的譜庫檢索定性,所獲得的高質量區和低質量區的質譜碎片都非常重要。因此,根據 7 種待研究 FWAs 的結構性質和儀器響應情況,經優化實驗條件,設置二級質譜的碰撞能量( CE) 為 35 eV、擴展碰撞能量( CES) 為 15 eV 時,對于每一種化合物均可獲得一張由不同碰撞能( 20,35 和 50 eV) 質譜圖疊加的數據質量較佳的 MS2 圖。低碰撞能有利于判斷主要碎片,高碰撞能可看到更多信息,有效實現準确的譜庫檢索。
 
3. 3 質譜的定性與定量分析
 
根據本實驗獲得的 7 種熒光增白劑的一級高分辨質譜圖( 均為[M+H]+ ) ,以及提取一級母離子得到的提取離子流色譜圖( 圖 2) ,得到 7 種熒光增白劑的分子母離子的測定值與理論值、質量精确度和保留時間( 表 1) ,7 種化合物的質量偏差的**值在 0. 1×10!6 ~ 1. 3 ×10!6 之間,遠小于 3. 0 ×10!6 ,均符合歐盟指令 2002 /657 /EC 的定性确證準則,根據保留時間與精确質量可實現對待測熒光增白劑的準确定性; 同時,還獲得了 7 種熒光增白劑的二級高分辨質譜圖( 圖 3) ,譜圖含有明顯的主要特征碎片,據此建立了這 7 種化合物的标準譜庫,在實際樣品檢測時可通過譜庫匹配檢索進行篩查,也有助于進一步的定性确證分析。在進行未知物篩查時,高精度的質量數、同位素峰分布以及特征碎片離子,可有效減少可能的分子式組成數,有利于推測化合物的分子式或結構,提高篩查效率,甚**能夠實現在沒有标準品的情況下對樣品中未知的熒光增白劑進行篩查确證。通過進一步收集熒光增白劑标準物質,逐步完善熒光增白劑的液質質譜庫,為今後形成标準化質譜庫提供支持,為開展篩查和評估食品及食品接觸材料中熒光增白劑的安全風險水平提供有力的技術支撐。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖 2 7 種 FWAs 标準溶液( 200 μg /L) 的提取離子流色譜圖
Fig. 2 Extracted chromatograms of seven FWAs standards ( 200 μg /L)
 
定量時,使用寬度為 0. 02 Da 的窗口提取一級母離子形成提取離子流色譜圖( 如圖 2 所示) ,以提取離子色譜峰的峰面積進行定量。由于 TRIPLE TOF 的第三個分析器是具有高分辨率的 TOF,因此具有
 
實現精确質量定量的性能。
 
3. 4 線性範圍和檢出限
 
配制質量濃度為 4,8,16,80,160,280 和 400 μg /L 的 7 種熒光增白劑系列混合标準溶液,在優化的實驗條件下測試,以提取目标離子的峰面積 y 對相應的質量濃度 x( μg /L) 進行線性回歸,繪制标準曲線,其相關系數均大于 0. 995( 見表 2) ,表明線性關系良好。以定量離子的 3 倍信噪比( S /N = 3) 的響 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖 3 7 種 FWAs 标準溶液( 200 μg /L) 的 TOF MS MS 二級質譜圖
Fig. 3 TOF-MS-MS spectra of seven FWAs standards ( 200 μg /L)
 
應值對應的化合物濃度作為儀器的檢出限 ( LOD) ,以 10 倍信噪比 ( S /N = 10 ) 計算儀器的定量限 ( LOQ) 。7 種熒光增白劑的線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表 2。
 
表 2 7 種熒光增白劑的線性方程、相關系數、儀器檢出限和方法定量限
Table 2 Calibration curve,correlation coefficient,LOD and MLOQ of 7 kinds of FWAs
 
熒光增白劑 線性方程 線性範圍 相關系數 檢出限 定量限
Linear range LOD LOQ
FWAs Regression equation Correlation coefficients
( μg /L) ( μg /L) ( μg /kg)
     
           
FWA 52 y = 29412x+1345 4 ~ 400 0. 9993 1. 0 10
FWA 135 y = 25306x+3567 4 ~ 400 0. 9995 1. 0 10
FWA 185 y = 21334x+3258 4 ~ 400 0. 9989 1. 0 10
FWA 393 y = 1595x+599 17 ~ 400 0. 9968 5. 0 42
FWA 367 y = 12757x+4089 7 ~ 400 0. 9996 2. 0 17
FWA 368 y = 1880x-409 14 ~ 400 0. 9991 4. 0 35
FWA 184 y = 10130x+4227 4 ~ 400 0. 9997 1. 0 10
           
 
3. 5 回收率和精密度
 
按本實驗條件,在陰性樣品基質中進行 3 個添加水平的加标回收實驗,每個添加水平平行實驗 6 次。回收率和精密度結果如表 3,3 個添加水平的平均回收率為 81. 2% ~ 98. 9% ,相對标準偏差為 5. 2% ~ 9. 1% ,表明方法具有良好的精密度和準确度。
 
3. 6 實際樣品的測定
 
應用本方法檢測了 13 個樣品,僅 1 個樣品檢出含有 FWA184,含量為 287 μg /kg。圖 4 顯示了陽性樣品的提取離子色譜圖( XIC) 、母離子質譜圖和二級質譜圖,使用軟件中的 XIC Manager 功能篩查顯示其相似度得分為 89. 7,表明具有較高的匹配度,篩查準确率高。
 
本研究建立了基于高效液相色譜串聯高分辨質譜( LC-TRIPLE-TOF) 技術的快速篩查和定量檢測食品接觸紙質材料中 7 種熒光增白劑的分析方法。樣品處理簡單,使用 TOF MS IDA MS-MS 采集模式,一次進樣可以同時獲得高質量準确度和高分辨率的一級質譜圖和二級質譜圖。通過保留時間、質量準确度、同位素分布、MS /MS 數據庫進行定性篩查,以提取一級母離子的離子流色譜圖進行定量分析,外标法定量,在 5. 5 min 内完成 7 種熒光增白劑的快速分析和鑒定; 同時,方法也可應用于食品接觸紙質材料中未知熒光增白劑的篩查,有助于加強非法添加熒光增白劑的監管。
表 3  7 種目标物的方法回收率和精密度( n = 6)            
Table 3  Method recovery and precision for seven FWAs ( n = 6)            
                   
熒光增白劑 添加量 回收率 相對标準偏差   熒光增白劑 添加量 回收率 相對标準偏差
Added Recovery RSD   Added Recovery   RSD
FWA   FWA  
( μg /kg) ( % ) ( % )   ( μg /kg) ( % )   ( % )  
         
                     
  10 86. 1 8. 1     17 84. 9   7. 5
FWA 52 20 93. 5 6. 4   FWA 367 34 85. 9   6. 5
  100 94. 1 9. 0     170 89. 3   5. 2
  10 81. 2 8. 8     35 95. 0   6. 9
FWA 135 20 83. 5 7. 3   FWA 368 70 94. 6   8. 1
  100 84. 8 6. 8     350 96. 8   8. 6
  10 89. 5 7. 0     10 90. 1   7. 9
FWA 185 20 87. 3 8. 9   FWA 184 20 95. 5   8. 4
  100 94. 1 7. 9     100 98. 9   8. 0
  42 94. 3 9. 1              
FWA 393 84 92. 9 8. 6              
  420 95. 6 7. 9              
                     
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖 4 陽性樣品中 FWA 184 提取離子色譜圖( A) ,母離子質譜圖( B) 和二級質譜圖( C)
 
Fig. 4 Extracted ion chromatogram ( A) ,MS ( B)  and MS2( C)  of FWA 184 in positive sample
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